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新型冠状病毒检测的主要分子学方法!

发布时间:2020-04-30 13:48:23 点击量:

 传染病(Infectious Diseases)是由各种病原体引起的能在人与人、动物与动物或人与动物之间相互传播的一类疾病。传染病造成人类健康风险,并导致约四分之一死亡人数。而呼吸道传染病是是病原体从呼吸道侵入而引起的传染病,呼吸道传染病是发病率最高也是最为常见的一种传染病。

冠状病毒属于冠状病毒科,可能引起呼吸系统疾病和神经系统疾病。迄今为止,已鉴定出六种人类冠状病毒(HCoV),分别为HCoV-229E,HCoV-HKU1,HCoV-OC43,HCoV-NL63,严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS)-CoV)。特别是,SARS-CoV和MERS-CoV曾经引起大流行。虽然我们在公共医疗保健方面做出了巨大的努力和取得了很大的进步,但是对抗由病毒引起的传染病仍然是一项艰巨的任务。

最近,新型冠状病毒COVID-19的出现挑战了全球公共卫生系统应对新型传染病的防线。分子诊断作为诊断技术的最先进的典型代表在新冠检测中产生了极其重要的作用。


PCR检测中应该把新型冠状病毒核酸(RNA)逆转录为DNA。在PCR反应体系中,包含一对特异性引物以及一个Taqman探针,该探针为一段特异性寡核苷酸序列,两端分别标记了报告荧光基团和淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;如反应体系存在靶序列,PCR反应时探针与模板结合,DNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性将探针酶切降解,报告基团与淬灭基团分离,发出荧光。每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子产生。荧光定量PCR仪能够监测出荧光到达预先设定阈值的循环数(Ct值)与病毒核酸浓度有关,病毒核酸浓度越高, Ct值越小。 PCR检测法具有特异性强,定量分析简便的优势,被认为是病毒检测的“金标准”。

LAMP是高效的新型等温核酸扩增方法。它通常用于DNA和RNA的扩增,由于其指数扩增特性和分别由4种不同的引物同时鉴定的6个不同的靶序列而具有很高的灵敏度和高特异性。LAMP测定快速且不需要昂贵的试剂或仪器。因此,LAMP检测的应用可能有助于降低检测冠状病毒的成本。在此,已经开发了许多基于LAMP的冠状病毒检测方法并将其应用于临床诊断。

CRISPR技术不仅是一种强大的基因编辑工具,也是有效的核酸检测平台。靶向基因组茫茫DNA序列中的特定序列,Cas13是一种依赖于RNA靶向的RNA核酸酶,专一的切割RNA,不切割DNA。CRISPR技术测试时需要先取得样本RNA,然后将其逆转录到DNA中,再通过一种名为等温扩增的技术进行扩增。之后,新冠病毒包膜和核衣壳的基因序列就可以被CRISPR-Cas12检测到,CRISPR-Cas12会切割确认病毒存在的报告分子。

世界上许多最常见或致命的人类病原体都是RNA病毒(例如埃博拉病毒、艾滋病病毒,流感病毒、SARS病毒等)此次在武汉爆发的新型冠状病毒,同样是RNA病毒,通过让被切割的RNA形成条带,形成视觉可见的结果,清晰直观展示病毒检测结果。


当前,COVID-19诊断的金标准是核酸检测,这种方法具有很高的灵敏度和特异性,但是它的分析需要专业设备和受过培训的技术人员,并且必须在特定的PCR实验室里才能完成。由于前期采样和预处理等问题,可能引起检测不准确的情况,但是如果配合血清学检测,如胶体金法,Elisa和化学发光法等,对两种抗体的监测可以使新冠的诊断达到更好的效果。

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